Mit dem Inkrafttreten der Novelle der Gentechnik-Sicherheitsverordnung (GenTSV) zum März 2021 ist es erforderlich, dass entsprechend § 7 Absatz 5 GenTSV das Fortbestehen bereits anerkannter biologischer Sicherheitsmaßnahmen (hier: Vektor- und Empfängersysteme) durch die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit bestätigt wird. Unter § 8 Absatz 1 der novellierten GenTSV wird ausgeführt, nach welchen Voraussetzungen die Verwendung eines Empfängerorganismus als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme anerkannt werden kann. Diese sind erfüllt, wenn 1. eine wissenschaftliche Beschreibung und eine taxonomische Einordnung des Empfängerorganismus vorliegen, 2. der Empfängerorganismus für Mensch, Tier und Pflanzen nicht pathogen ist und keine umweltgefährdenden Eigenschaften aufweist, 3. die Vermehrung des Empfängerorganismus nur unter Bedingungen möglich ist, die außerhalb gentechnischer Anlagen selten oder nicht angetroffen werden und 4. der Empfängerorganismus nur einen geringen horizontalen Genaustausch mit anderen Spezies betreibt.

In dieser Stellungnahme wird geprüft und bewertet, ob asporogene, thyminabhängige Mutanten von Bacillus subtilis 168 die oben genannten Voraussetzungen erfüllen.

Asporogene, thyminabhängige Mutanten von B. subtilis 168 wurden bereits in den seit 1978 geltenden „Richtlinien zum Schutz vor Gefahren durch in-vitro neukombinierte Nukleinsäuren“ (zuletzt in der 5. überarbeiteten Fassung von 1986) als biologische Sicherheitsmaßnahme (Empfängerorganismus) benannt. Dies wurde im 1. Gentechnikgesetz von 1990 fortgeschrieben. Ursprünglich waren solche Mutantenstämme bereits seit den 70er Jahren in den USA vom National Institutes of Health (NIH) als Teil von „host-vector-systems (HV)“ zertifiziert worden.

1.1 Wissenschaftliche Beschreibung

Die Spezies B. subtilis gehört zur Familie der Bacillaceae. Die Familie umfasst mehrheitlich Gram-positive, sporu­lierende, chemoorganoheterotrophe, aerobe und fakultativ anaerobe stäbchenförmige Bakterienarten [1]. B. subtilis kommt weltweit in Böden vor [2].

Bei dem Stamm 168 von B. subtilis handelt es sich um ein Tryptophan-auxotrophes Derivat des Stammes B. subtilis Marburg. B. subtilis Marburg wurde um 1900 in Deutschland aus Heu isoliert und in den 1930er Jahren unter der Bezeichnung Marburg-Stamm in die Stammsammlung der New York State Agricultural Experiment Station aufgenommen [3]. Die B. subtilis-Stämme ATCC 6051 und NCIB 3610 sind noch heute existierende direkte Nachkommen von B. subtilis Marburg [4]. B. subtilis 168 wurde im Jahr 1947 durch Strahlenmutagenese erzeugt [5] und wurde seit 1958 aufgrund seiner natürlichen Kompetenz für die Transformation mit freier DNA intensiv in genetischen Studien untersucht [6]. Bis in die 1980er Jahre, bevor sich der Einsatz der Kryokonservierung etablierte, wurden B. subtilis-Stämme auf Agarplatten oder in Stichagar-Kultur aufbewahrt oder in ihrer Dauerform als Endosporen in Glycerin für längere Zeiträume bei –20 °C gelagert [7]. Die Genome von B. subtilis 168 sowie des parentalen Stammes ATCC 6051 sind vollständig sequenziert [8–10]. Auf Grundlage der Sequenzierungen erfolgte im Jahr 1999 die Einordnung des Stammes B. subtilis 168 in die Subspezies Bacillus subtilis subsp. subtilis [11]. Der Stamm B. subtilis 168 wird vielseitig in der Biotechnologie verwendet.

Zusammenfassend handelt es sich bei B. subtilis 168 um einen wissenschaftlich sehr gut charakterisierten Modellorganismus mit einer taxonomisch eindeutigen Einordnung.

1.2 Pathogenes Potential von B. subtilis 168

Nur selten traten in der Vergangenheit Infektionen mit B. subtilis beim Menschen auf, weshalb B. subtilis gelegentlich in der Literatur als pathogen benannt wird [12]. In den beschriebenen Fällen handelt es sich um immunkompromittierte Patienten oder Personen mit starkem Drogenmissbrauch. Es sind keine Fälle bekannt, die ein pathogenes Potential von B. subtilis für den Menschen im Allgemeinen aufzeigen [12].

In B. subtilis 168 sind die meisten Virulenzfaktorgene abwesend, die in pathogenen Bakterien der Gattung Bacillus vorkommen [13, 14]. Dazu zählen Gene zur Expression von Enterotoxinen, Hämolysinen und anderen Virulenzfaktoren [13, 14]. Das pathogene Potential von B. subtilis 168 wurde in Tiermodellen untersucht. Im Mausmodell ist die intraperitoneale Injektion von 2,5 × 10⁶ koloniebildenden Einheiten (KBE) von B. subtilis 168 nicht gesundheitsschädlich [15]. Die Inokulation mit derselben Menge eines pathogenen B. subtilis-Stammes führt zu einer Letalität von 70 %. Der pathogene B. subtilis-Stamm ist im Gegensatz zu B. subtilis 168 in der Lage, intrazellulär in Phagozyten zu replizieren [15]. Die orale Inokulation mit einer Einzeldosis von 1 × 10⁹ KBE von B. subtilis 168 führt im Mausmodell zu keinen gesundheitlichen Problemen [14]. Dabei persistieren vegetative Zellen und Endosporen von B. subtilis 168 nicht länger als zwölf Tage im Darmtrakt [14]. Im Gegensatz zu Listeria monocytogenes ist B. subtilis 168 kaum in der Lage, an Epithelzellen zu adhärieren und wirkt nicht zytotoxisch auf menschliche Epithelzellen in Kultur [14]. Es liegen keine Berichte über Infektionen mit B. subtilis 168 bei Tier und Mensch vor.

Im Allgemeinen ist B. subtilis in der Lage, die Rhizosphäre von Pflanzen zu besiedeln [16, 17]. Dabei ist die Fähigkeit zur Schwarmmotilität eine notwendige Vorrausetzung für eine effektive Kolonisierung der Rhizosphäre durch B. subtilis [18]. Aufgrund einer Leserasterverschiebung im swrA-Gen ist B. subtilis 168 hingegen nicht zur Schwarmmotilität befähigt und kann somit Wurzeln nicht effizient besiedeln [4, 19]. Berichte über eine phytopathogene Wirkung der Spezies B. subtilis im Allgemeinen und dem Stamm 168 im Speziellen liegen nicht vor.

B. subtilis 168 ist apathogen und ohne Gefährdungspotential für Mensch, Tier und Pflanze.

1.3 Vermehrungsfähigkeit von B. subtilis 168 außerhalb von gentechnischen Anlagen

In vielfältigen Studien wurde das Überleben des domestizierten Stammes B. subtilis 168 untersucht. Für solche nur durch in vitro-Kultur gehaltenen Stämme ist bekannt, dass ihre Überlebensfähigkeit in natürlichen Habitaten oft reduziert ist. Die Zahl vegetativer Zellen von B. subtilis 168 nimmt beispielsweise in Süßwasser oder Abwasser innerhalb von zwei Tagen um vier bis sechs Zehnerpotenzen ab [20–22]. In Böden ist die verfügbare Datenlage zum Überleben von B. subtilis 168 aufgrund unterschiedlicher Versuchsgestaltungen und -bedingungen (u. a. unterschiedliche Böden, steril bzw. nicht steril, verschiedene Temperaturen, unterschiedliche Supplementierungen) uneinheitlich und begrenzt vergleichbar.

So sank die Bakteriendichte nach Inokulation von steriler Blumenerde mit 2 × 10⁷ KBE B. subtilis 168 je g Boden innerhalb von zwei Tagen auf ein Zehntel und blieb anschließend über 80 Tage stabil [23]. In anderen Untersuchungen wuchs die Bakteriendichte nach Inokulation von 2 × 10⁸ KBE B. subtilis 168 Auxotrophie-Stämmen je g Boden innerhalb von 24 Stunden auf das Zehnfache an und blieb anschließend bis zum Versuchsende nach acht bzw. 15 Tagen stabil [24, 25]. In sterilem Kompostboden wurde eine Verdopplung von B. subtilis 168 bei 37 °C in sieben Tagen gezeigt, die über 30 Tage (Versuchsende) stabil blieb [26]. In unsterilem Kompost fiel die Bakterienzahl in sieben Tagen auf ein Hundertstel und blieb anschließend bis Tag 30 (Versuchsende) konstant [26]. In unsterilem Kompost bei 37 °C fiel die Bakterienzahl von 10⁷ auf 10⁶ in sieben Tagen und blieb bis zum Versuchsende nach 28 Tagen konstant [27]. In den Versuchen sank die Koloniebildung durch endogene Bodenbakterien ebenfalls auf ein Zehntel. Ähnlich verlief das Überleben auch in sterilem Kompost. In einer weiteren Studie wurde keine Abnahme der in eine nicht näher charakterisierte Bodenprobe eingebrachten Zellen (4,6 × 10⁶/​g Boden) über einen Zeitraum von 15 Tagen beobachtet [28]. In einem ebenfalls nicht näher charakterisierten sterilen Boden sank die KBE um drei Zehnerpotenzen in drei Tagen [29]. In einem sterilen sandigen Lehmboden stieg die Zellzahl auf das Zehnfache in drei Tagen an, im nicht sterilen Boden sank die Zahl um drei Zehnerpotenzen in drei Tagen [20]. In beiden Fällen waren die Koloniebildner in dem Boden am Ende Sporen. In Untersuchungen mit B. subtilis-Stämmen, die nicht zur 168er-Linie gehören, sank das Überleben in verschiedenen unsterilen Böden um drei bis vier Zehnerpotenzen in drei bis 20 Tagen [17, 30].

1.3.1 Auswirkung von spo-Mutationen

Die Daten weisen darauf hin, dass B. subtilis 168 in der Lage ist, in Böden außerhalb von gentechnischen Anlagen zu überleben und sich gegebenenfalls auch zu vermehren. Das dauerhafte Überleben von B. subtilis 168 in der Umwelt beruht im Wesentlichen auf der Bildung von Sporen. Der jeweilige Übergang vegetativer Zellen in Sporen wird durch die Lebensbedingungen gesteuert [31]. In den oben genannten Experimenten wurde unter den überlebenden Koloniebildnern auch der Anteil von Sporen bestimmt. Dieser lag nach sieben Tagen in sterilen und unsterilen Kompostböden bei 100 % unter allen Überlebenden und blieb danach konstant [27]. In Experimenten mit sterilem Kompostboden war der Anteil von Sporen ca. 1 % nach sieben Tagen und ca. 100 % nach 28 Tagen [26]. In unsterilem Kompostboden erreichte der Anteil von Sporen ca. 1 % nach 28 Tagen [26]. Bei Untersuchungen mit steriler Blumenerde lag der Anteil von Sporen zwischen 80 und 90 % nach drei Tagen [25]. In anderen Langzeitstudien mit steriler Blumenerde betrug der Anteil unter den Koloniebildnern 12 – 20 % Sporen nach 45 Tagen [23].

Sporen bergen mit ihrer hohen Überdauerungsfähigkeit und der Möglichkeit zur Translokation in andere Habitate, in welchen ein Auskeimen und vegetatives Wachstum möglich ist, die Gefahr der unerwünschten Ausbreitung ­gentechnischer Konstrukte. Deshalb hat das amerikanische NIH in seinen Anforderungen an biologische Sicherheitsmaßnahmen (HV1 bzw. HV2) 1978 für B. subtilis u. a. die Ausschaltung der Sporenbildung durch Defektmutationen (spo) gefordert [32].

Die Endosporen weisen gegenüber chemischen und physikalischen Belastungen eine hohe Widerstandsfähigkeit auf [33]. Die molekularen Abläufe der Endosporenbildung in B. subtilis 168 wurden umfassend untersucht [34, 35]. ­Die Endosporenbildung findet bei in vitro-Kultur am Ende der exponentiellen Vermehrung statt und wird z. B. durch Nährstoffmangel und hohe Populationsdichte induziert. Die Bildung der Endosporen ist ein äußerst komplexer Vorgang, an dem nach heutigem Stand mehr als 100 Gene beteiligt sind [36]. Auf Basis morphologischer Veränderungen der Zellen wird die Sporulation in acht Phasen unterteilt. Die Bezeichnung von asporogenen Mutanten richtet sich nach der von der inaktivierenden Mutation betroffenen Phase (spo0 – spoVII). Es gibt eine Vielzahl von asporogenen Mutanten mit Mutationen in unterschiedlichen Genen [37, 38]. Sporulationsmutanten können direkt zurückmutieren (isolokale Reversion bzw. intragenische Suppression), sie können aber auch in ihrer phänotypischen Ausprägung durch Mutationen in anderen Genen supprimiert werden (extragenische Suppressormutationen). Für solche Suppressormutationen gibt es wegen der Komplexität der Sporenbildung zahlreiche Möglichkeiten (z. B. spo0A und spo0F-Supressormutationen [39, 40]).

Um eine Sporulation sicher auszuschließen, gibt das NIH eine Reversionshäufigkeit von ≤ 10^–7 für spo-Mutanten vor, die als Teil biologischer Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden sollen. Diese niedrige Reversionshäufigkeit muss jeweils bei der Zertifizierung belegt werden. Als spo-Mutationen werden beispielsweise solche im Gen spo0A genutzt, dem Hauptregulator der frühen Phase der Sporulation, der über 100 Gene reguliert [41]. Einige wenige Beispiele für beim NIH zertifizierte Stämme sind in der Literatur zu finden. Sie fallen in zwei Kategorien, von denen jeweils ein Beispiel (RUB331; ASB298) vorgestellt wird. Der Genotyp von RUB331 ist B. subtilis 168 thyA1, thyB1, spo-331. Er wurde zum amerikanischen und europäischen Patent angemeldet (US4302544A, EP0029497A1). Die Rückmutationshäufigkeit der molekular nicht genau beschriebenen spo-331-Mutation wird in der Patentschrift auf Basis von in vitro-Experimenten (anhand des Wechsels der Koloniemorphologie) mit ≤ 10^–7 angegeben. Ein Überleben in Böden wurde nicht angegeben. Young et al. (1980) beschreiben, dass dieser Stamm eine Abnahme der Zellzahl um drei Zehnerpotenzen in 15 Tagen im Boden zeigte [28]. Aus den Daten geht aber auch hervor (Abb. 12, Legende), dass unter den Überlebenden sporulationsfähige Rückmutanten tatsächlich mit einer Häufigkeit von bis zu 10^–3 auftreten. Diese Rückmutanten beruhen wahrscheinlich auf den oben genannten, relativ häufigen extragenischen Suppressormuta­tionen. Wegen dieser hohen Rückmutabilität zur Sporulationsfähigkeit erfüllt der Stamm RUB331 im Grunde die Anforderungen für eine biologische Sicherheitsmaßnahme nicht.

Der Genotyp des zweiten zertifizierten B. subtilis 168-Stammes, ASB298, lautet thyA, thyB, spoAΔ677, uvr-1, dal, citDΔ29 (uvrC), str^d[29]. Alle sieben Mutationen sollen zum verringerten Überleben in der Umwelt beitragen. Die dal-Mutation (D-, L-Alanin-Racemase-Defizienz) behindert die Peptidoglykanbiosynthese bei der Zellwandbildung; die uvr-1 Mutation macht die Zellen hoch sensibel gegen UV und andere DNA-schädigende Agenzien; die citD-Deletion umfasst den citK-Lokus, einschließlich zusätzlicher Gene des für die Sporulation erforderlichen Citratzyklus; die str^d-Mutation führt zur Abhängigkeit der Vermehrung von Streptomycin (1 mg/​ml). Die KBE dieses Stammes sinken in sterilem Boden in zwei Tagen um fünf Zehnerpotenzen, die spontane spoAΔ677-Mutante revertiert nachweislich um weniger als 10^–7 [29]. Der Beitrag der einzelnen Mutationen zur Reduktion des Überlebens des Stammes in der Umwelt wurde nicht bestimmt. Der Stamm erfüllt die NIH-Anforderungen.

Die Verhinderung der Sporenbildung durch eine sehr selten revertierende spo-Mutation ist ein grundlegender Beitrag zur Verhinderung der Überdauerung von B.subtilis 168 außerhalb gentechnischer Anlagen.

1.3.2 Auswirkung von thy-Mutationen

Eine Blockierung der vegetativen Vermehrung der Zellen in der Umwelt kann durch Mutationen zum Wuchsstoffbedarf erfolgen, der in der Umwelt nicht ausreichend erfüllt wird. Im Gegensatz zu den meisten anderen Nährstoffentzügen und -auxotrophien, die nur einen biostatischen Effekt auf Mikroorganismen haben, führt Thyminmangel zum Tod innerhalb einer Generation. Das Phänomen des Thyminmangeltodes wurde bereits in den 50er Jahren [42] entdeckt und wurde in Prokaryoten und Eukaryoten umfassend untersucht [43].

B. subtilis 168 trägt zwei Thymidylat-Synthase-Gene (thyA, thyB), deren Inaktivierung zu einer Thyminauxotrophie führt [44, 45]. Die Thymin-abhängigen Mutanten von B. subtilis 168 sterben bei fehlender Supplementierung mit Thymin innerhalb weniger Stunden [46–49]. Ohne Thyminzusatz kommt es zu DNA-Einzel- und -Doppelstrangbrüchen und dem irreversiblen Verlust von 10 bis 15 % der DNA [43, 46]. Um den Thyminmangeltod in Kultur zu vermeiden, ist eine Thymin- bzw. Thymidinkonzentration von mindestens 5 µg/​ml erforderlich [49]. In Böden liegt Thymin frei und in Form von DNA in einer durchschnittlichen Konzentration von ~ 36 µg Thymin/​g getrockneten Bodenmaterial vor (Werte aus 15 Böden verschiedener Lokalisation, Tiefe und Beschaffenheit) [50]. Thymin kann ungehindert in B. subtilis 168-Zellen diffundieren, wobei die zelluläre Konzentration äquivalent zur Thyminkonzentration im umgebenden Medium ist [51]. Mithilfe der Kompetenz kann DNA von B. subtilis aus der Umgebung aufgenommen und die Komponenten im Stoffwechsel verwertet werden [52, 53]. Dass thyminabhängige Bakterien auch ohne Thyminzusatz in Erde vermehrungsfähig sind, wurde bereits für E. coli K12-abgeleitete Stämme berichtet [54]. Auch B. subtilis 168 thyA, thyB (RUB830) überlebt uneingeschränkt in Bodenproben über einen Zeitraum von mindestens 15 Tagen [28]. Die Thyminauxotrophie erscheint für die Reduktion des Überlebens von B. subtilis 168 in der Umwelt ungeeignet.

1.4 Horizontaler Gentransfer von B. subtilis 168 mit anderen Organismen

Horizontaler Gentransfer bei Bakterien kann durch Prozesse wie Transformation, Transduktion, Konjugation und ­Mobilisierung von genetischem Material stattfinden, deren molekulare Abläufe umfassend untersucht wurden [55].

Der Stamm B. subtilis 168 ist in der Lage, DNA aktiv aus der Umgebung aufzunehmen, und weist somit eine natürliche Kompetenz für die Transformation mit freier DNA auf [6]. Die Kompetenz von B. subtilis 168 ist am höchsten zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase [56]. Die Aufnahme von DNA erfolgt nach Fragmentierung als Einzelstrang entlang eines Pseudopilus durch die ComEC-Pore [57, 58]. Nach der Aufnahme der DNA kommt es im Zytoplasma zu transienten, nicht kovalenten Heteroduplexkomplexen aus Donor- und Rezipienten-DNA, sodass Einzelstrang-DNA-Abschnitte des Donors durch Rekombinationsprozesse integriert werden können [59, 60]. In zeitlicher Koinzidenz mit der Kompetenzentwicklung setzt B. subtilis 168 während des Wachstums in Kulturmedien DNA frei [61, 62]. Alternativ zur natürlichen Transformation kann DNA unter solchen experimentellen Bedingungen in B. subtilis-Zellen gelangen, die die Membran der Bakterien für DNA durchlässig machen, z. B. durch die Anwendung physikalischer Methoden (Elektroporation) [63].

Ein anderer Prozess des horizontalen Gentransfers ist die Übertragung von Plasmiden mittels Konjugation. Die bakterielle Konjugation ist ein Vorgang, in dem es zum physikalischen Kontakt zwischen Donor- und Rezipientenzellen und anschließend zum Transfer eines DNA-Einzelstranges kommt. Der Stamm B. subtilis 168 enthält keine Plasmide, so dass ein Gentransfer mithilfe der Konjugation einschließlich der Mobilisierung ausgeschlossen ist [9].

Zum horizontalen Gentransfer bei Bakterien tragen generell transduzierende Phagen mit breitem Wirtsbereich bei. Solche Phagen können gelegentlich ausschließlich DNA bakteriellen Ursprungs (chromosomale- oder Plasmid-DNA) in infektiöse Phagenpartikel verpacken und Wirte aus mehreren Bakterienfamilien infizieren. Nach Prophagen-induzierenden Behandlungen können die zwei Prophagen PBSX und SPβ aus dem Chromosom von B. subtilis 168 ausgeschnitten werden [9]. SPβ ist ein temperenter Phage, der nur spezifische bakterielle DNA-Abschnitte benachbart zum Integrationsort übertragen kann (spezielle Transduktion) [64]. PBSX ist ein defekter Phage, dessen Partikel ausschließlich chromosomale DNA beinhalten. PBSX kann an suszeptible Zellen adsorbieren, aber es kommt nicht zur DNA-Injektion in die Zelle. Die Zellen werden dabei abgetötet (Bacteriocinwirkung) [65]. Es sind bislang keine generell transduzierenden Phagen mit weitem Wirtsbereich bekannt, die B. subtilis 168 infizieren können. Häufig werden in gentechnischen Arbeiten mit B. subtilis 168 die generell transduzierenden Phagen PBS1 und SP-10 eingesetzt, die jedoch nur einige B. subtilis-Stämme infizieren können und somit keinen breiten Wirtsbereich besitzen [66–68].

Nach § 8 Absatz 1 GenTSV werden asporogene (spo) Mutanten als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme anerkannt, wenn nachweislich die vorliegende spo-Mutation mit einer Häufigkeit von ≤ 10^–7 zurückmutiert und mindestens eine weitere, die vegetative Vermehrung der Zellen unter natürlichen Umweltbedingungen behindernde Mutation vorliegt. Thyminmangelmutationen sind nicht geeignet für eine Verhinderung des Umweltüberlebens. Die Eignung des jeweiligen Stammes wird als Einzelfallentscheidung von der ZKBS geprüft.

Folgende Erfordernisse nach § 8 Absatz 1 GenTSV sind für Bacillus subtilis 168 spo, thyA, thyB Stämme erfüllt: Sie sind wissenschaftlich sehr gut beschrieben und apathogen für Mensch, Tier und Pflanze, horizontaler Gentransfer von diesen Stämmen auf andere Bakterien ist nicht zu erwarten. Allerdings ist ein Überleben der Stämme außerhalb gentechnischer Anlagen nicht auszuschließen, da die Thyminabhängigkeit in Böden ausgeglichen werden kann und die vegetative Vermehrung dort nicht durch Thyminmangeltod begrenzt wird. Die Wirksamkeit der Vermehrungs­begrenzung in der Umwelt durch andere Mutationen (z. B. dal oder str^d) muss im Einzelfall durch Laborexperimente nachgewiesen werden. Der Stamm ASB298 erfüllt alle Voraussetzungen für die Anerkennung als Teil einer biologischen Sicherheitsmaßnahme. Dieser Stamm wird von der American Type Culture Collection angeboten.

Informationen dazu, welche asporogenen B. subtilis 168-Mutanten entsprechend den in dieser Stellungnahme festgelegten Kriterien als Empfängerstämme für biologische Sicherheitsmaßnahmen geeignet sind, werden in der Datenbank der Empfängerstämme für biologische Sicherheitsmaßnahmen gesammelt und zur Verfügung gestellt, die von der ZKBS-Geschäftsstelle geführt wird.

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